Im dritten Teil von Spider-Man hat Peter Parker (Tobey Maguire) es endlich geschafft, seine Liebe zur Mary Jane (Kirsten Dunst) und seine Pflichten als Superheld in Einklang zu bringen. Doch schon ziehen am Horizont dunkle Wolken auf. Als sich Spider-Mans Anzug plötzlich pechschwarz verfärbt und ihm neue, ungeahnte Kräfte verleiht, verändert dies auch Peter und bringt die dunklen, rachsüchtigen Seiten seines Charakters ans Licht, Eigenschaften, die er schwer kontrollieren und beherrschen kann.
Und bald ist Peter gezwungen, sich zwischen der verführerischen Kraft des neuen Anzugs und dem mitführenden Helden, der er einst war, zu entscheiden - denn zwei der meist gefürchteten Schurken, Sandman (Thomas Haden Church) und Venom (Topher Grace), könnten beispiellose Macht erlangen und in ihrer Rachsucht Peter und jeden, den er liebt, bedrohen.